Técnicas de obtención de factores de crecimiento

La ingeniería genética persigue la modificación del patrimonio hereditario introduciendo o seleccionando uno o varios genes pertenecientes a un organismo de una especie distinta (ya sea en bacterias ya sea en células eucariotas vegetales o animales) para que sintetice la proteína deseada.

Estos adelantos no sólo han permitido la purifi­cación de los diferentes factores de crecimiento sino también la producción de cantidades grandes de estas proteínas a través de algunas técnicas de ingeniería genética, entre las que tenemos:

a. La electroforesis en gel. Identifica las proteínas dependiendo de su carga eléctrica.

b. Marcadores. Segmentos reconocibles de ADN a lo largo de la cadena que permite estimar la localización relativa de otros genes.

c. La técnica ELISA. (Enzyme Linked Inmuno SorbentAssay) reconoce configuraciones espacia­les de zonas de proteínas o ácidos nucleicos.

d. Amplificación del gen. Es la obtención de nume­rosas copias de un fragmento específico del ADN, y se logra con las técnicas de Southern Blot y el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

e. ADN Recombinante. Consiste en la lectura precisa de la secuencia de nucleótidos del ADN y el recorte con las enzimas de restricción en los lugares precisos y conocidos Las secuencias de ADN recombinadas pueden ser obtenidas por diferentes medios: por síntesis química, por co­pia del ARN mensajero, por un ADN polimerasa etcétera.

Plasma autólogo rico en factores  (PRFC)

Es un preparado autólogo, obtenido por centrifu­gación de la sangre del paciente a intervenir, cuya función está directamente ligada a la degranulación de las plaquetas -con la consiguiente liberación de los factores de crecimiento que están dentro de su citoplasma-. Mediante la centrifugación de la sangre, también se obtiene plasma pobre en plaquetas (PPP), que es el plasma residual obtenido en la segunda parte del procedimiento, que contiene los factores de la coagulación y fundamentalmente el fibrinógeno. Su función en la última etapa de la cascada de coagula­ción es la de convertirse en fibrina, previa activación por la molécula de trombina y calcio. La malla de fibrina así constituida permite el atrapamiento de las plaquetas y la estabilización del coágulo sanguíneo, contribuyendo también a la rápida y efectiva cicatri­zación de los tejidos blandos que cubren la zona a regenerar.

Fig. 215-4 Técnica de obtención de factores de crecimiento

Procedimiento para su obtención

Se realiza la extracción de sangre al paciente (entre 10 y 40 ce), dependiendo esto de la cantidad de plas­ma rico en plaquetas (PRP) y plasma pobre en plaquetas (PPP) que se requiera, teniendo en cuenta que por cada 10 ce de sangre, se obtiene aproximadamente 1 cm. de PRP y 1 cm. de PPP (Fig. 215- 4A). Se agrega la sangre a tubos estériles que tienen un 3.8% de citrato de sodio como anticoagulante (Fig. 215-4B).

Se procede al centrifugado durante 5 minutos a 350 g aprox., donde obtendremos una separación en función a las densidades de sus tres componentes básicos (de menor a mayor densidad): el plasma pobre en plaquetas (PPP) es plasma acelular; el plasma rico en plaquetas (PRP), que es el que mayor concentración tiene de plaquetas, y por lo tanto, mayor concentración de FC. Después aparece la línea de células blancas y por último, los glóbulos rojos. (Fig. 215-4C, 215-4D y 215-5).

Clínicamente se ha demostrado que una pequeña porción de la parte superior de la capa de células rojas, contiene plaquetas más inmaduras y más grandes, por lo tanto también se incluye en el PRP (a esto se debe su color rosado).

Luego, se procede a la extracción de plasma rico en factores de crecimiento con la penetración de la pipeta en el nivel elegido con mayor concentración de plaque­tas (Fig. 215-4E).

Por último, se procede a la aplicación del plasma rico en factores de crecimiento en el lugar indicado ya sea bajo anestesia general o neuroleptoanalgesia.

Aplicaciones en diferentes áreas médicas

Las aplicaciones clínicas potenciales de los factores de crecimiento son numerosas10. En hemato-oncología, se han aplicado diversos factores de crecimiento hematopoyéticos como la eritropoyetina aprobada por la FDA para el tratamiento de diferentes tipos de anemia: el factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) y el factor estimulante de colonia de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) usados para mielosupresión y otras citopenias secundarias a quimioterapia; los interferones para tratamiento de entidades malignas. En oftalmología el factor de crecimiento epidérmico (EGF) tópico para daños corneales y conjuntivales. En otorrinolaringología, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF) han mostrado ser eficaces en la remodelación de la membrana timpánica.

Fig. 215-5. Componentes sanguíneos distribuidos por peso molecular.

En neurología, los factores de crecimiento nervioso (NGF) se han usado para trastornos degenerativos tipo Alzheimer y en tratamiento de lesiones traumáticas de los nervios. En endocrinología el factor de creci­miento tipo insulina (IFGI) aplicado para retardo de crecimiento de origen hormonal, y en diabetes mellitus se han observado algunos efectos pero aún está en etapas experimentales. En cirugía cardiovascular se han utilizado inyecciones intramusculares de vectores virales con plásmidos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) para mejorar la circulación periférica. También se han publicado resultados satis­factorios de la aplicación del factor VEGF en pacientes con isquemia del miocardio obteniendo reducción del dolor (angina de pecho), mejoría angiográfica y por tomografia.
Hasta ahora no hay grandes preocupaciones sobre la toxicidad de factores de crecimiento tópicos por parte de los ensayos clínicos tempranos (Fase I y II). Sin embargo, es necesario más tiempo pues muchos de estos factores sólo se han estudiado durante cinco y diez años. El desarrollo de la aprobación de la FDA de los agentes curativos es lento, principalmente debido a las normas estrictas necesarias para satisfacer los requisitos.

Aplicaciones en cirugía plástica
Factores de crecimiento en heridas crónicas

Entre las heridas abiertas crónicas que no cicatrizan o tienen demoras en la reepitelización, se incluyen lesiones, neuropatías del diabético en extremidades inferiores, heridas o lesiones por presión, úlceras por estasis venoso, y lesiones que no cicatrizan adecuada­mente en pacientes inmunocomprometidos. Aunque se han propuesto muchas razones para explicar la causa que evita la adecuada cicatrización de estas heridas, no se ha podido establecer un criterio único y la causa más probable podría llegar a ser de origen multifactorial.

Existen diversas circunstancias asociadas a pato­logías o hábitos que dificultan la secuencia biológica del proceso de cicatrización11'12, entre las que tenemos:
factores locales como infecciones, cuerpo extraño, isquemia, trauma, radiación, toxinas locales, insuficiencia arterial y venosa, hipertermia; otros factores sistémicos como las deficiencias nutricionales, diabetes, enfermedades hepáticas; algunos hábitos como el alcoholismo y el tabaquismo13'14-15; uso de medicamen­tos como corticoides y agentes quimioterapéuticos y otras circunstancias como factores raciales, ubicación de la herida y técnica empleada, que pueden incidir negativamente en la cicatrización en cirugías elec­tivas. Su reconocimiento ayudará a evitar posibles complicaciones.

Los estudios publicados con factores de crecimiento recombinantes en heridas crónicas muestran resul­tados contradictorios, probablemente por la falta de seguimiento a largo plazo. Brown, et alle, informaron que el tratamiento tópico de sitios donantes de piel con FCE acelera el índice de regeneración epitelial en todos los pacientes con un promedio de 1.5 días, utilizando PCE cada 12 horas en un vehículo de sulfadiazína de plata. Falanga, et al17, publican un estudio doble ciego en 44 pacientes con úlceras venosas sin obtener diferencias significativas entre los que se les aplicó el tópico y los controles.

Las úlceras diabéticas crónicas secundarias a enfermedad oclusiva de grandes vasos a menudo requieren manejo quirúrgico. Por otro lado, úlceras de miembros inferiores secundarias a la alteración microvascular como en la diabetes, la enfermedad neuropática y/o los estasis venosas no son a menudo dóciles a la revascularización. La infección, isquemia y trauma repetido pueden contribuir al desarrollo de ulceras crónicas.

Todas estas lesiones que no cicatrizan han mostrado niveles sumamente bajos de factores de crecimiento, i aplicación ha sido estudiada en úlceras de pacien-> diabéticos de diversas etiologías, sin embargo, los mejores resultados han sido observados en úlceras •europáticas18.

La mayoría de los estudios han usado el factor cicatrizante de heridas derivado de plaquetas autólogo (FCHDP autólogo), el cual contiene principalmente factor plaquetario-4, FCDP, FCT-J3 y FCE. En estudios 3le ciego el FCHDP aplicado tópicamente acelera el ce de cicatrización19. Por el contrario, el factor de liento derivado de plaquetas (FCDP) en forma aislada, aplicado tópicamente, no produjo mejorías significativas20.

Jean Louis, et al21, informan en un estudio piloto con factor de crecimiento fibroblástico (FCF) en úlceras diabéticas que no hay diferencias en la cicatrización comparado con el uso de placebo, explicando esta falta de efecto por las alteraciones que presentan los diabéticos en la cicatrización, el cual requiere probablemente la combinación de varios factores de crecimiento así como el efecto sinérgico con la insulina22.

La administración de varios factores de crecimiento, incluso el isómero recombinante de PDGF y bFGF, han mostrado mejoría clínica tanto en animales como en humanos23, en ensayos clínicos fase III y aceptados por la FDA para su aplicación clínica. En 3 de 4 estudios clínicos multicéntricos, para evaluar la eficacia ica del Becaplermin® un factor de crecimiento derivado de plaquetas recombinante humano (rhPD-GF-BB) en pacientes con úlceras neuropáticas se vio un incremento en la velocidad de cicatrización con respecto al grupo control. De hecho, el Becaplermin, es el primer factor de crecimiento aceptado por la FDA disponible para el tratamiento de úlceras diabéticas neuropáticas2324.

En cuanto a las lesiones por presión se ha visto que la prevención y la alteración de las fuerzas locales así como el debridamiento local cuando esté indicado son de gran utilidad, Sin embargo, recientes ensayos clínicos con el factor de crecimiento recombinante derivado de plaquetas (recombinant PDGF-BB) han mostrado resultados prometedores acelerando el proceso de curación y cicatrización de heridas por presión avanzadas25-26-27.

Pacientes que han recibido tratamiento crónico con corticoesteroides, o que han recibido quimioterapia o radioterapia presentan grandes alteraciones de la cicatrización. En estos pacientes, la aplicación en modelos animales de TGF-beta 1 revierte parcialmente esta situación28.

Por otro lado, pacientes con infección activa o aque­llos que estén en estado de sepsis profunda presentan retardos significativos en la cicatrización. En estos pacientes sépticos, la neutralización de las citoquinas pro-inflamatorias y factores de crecimiento que pue­den ser los responsables del retardo en la cicatrización podrían favorecer el tratamiento.

Factores de crecimiento en cicatrices hipertróficas y queloides

En las lesiones cutáneas, el resultado de una res­puesta excesiva o exagerada del proceso normal de cicatrización lleva a la formación de cicatrices hiper­tróficas, queloides, y contracturas.

Por definición, las cicatrices hipertróficas son levan­tadas pero no sobrepasan los bordes de la herida, y retroceden a menudo con el tiempo; mientras que los queloides crecen más allá de los bordes de la herida y pueden continuar creciendo porque sigue activa la cicatrización. Ambas condiciones se asocian a una respuesta inflamatoria excesiva y/o prolongada y a la producción de matriz extracelular, incluyendo aumento en los depósitos de colágeno y disminución de su metabolismo.

Las citoquinas y factores de cre­cimiento juegan un papel importante en la patología de queloides y cicatrices hipertróficas29.

El factor de crecimiento transformante beta (TGF-[beta])j parece tener el efecto más intenso en promover síntesis de colágeno que favorece la fibrosis, y se han descubierto niveles elevados de mRNA, de TGF-[beta] 1 en queloides y cicatrices hipertróficas30 31. Se ha podido establecer que el TGF-[beta], y el TGF-[beta]2 pro­mueven la cicatrización, mientras que el TGF-[beta]3 puede reducirla. La administración de anticuerpos que neutralicen el efecto del TGF-[beta]j y TGF-[beta]2 así como la administración exógeno de TGF-[beta]3 han sido utilizados para disminuir la actividad cicatrizal en ratas, lo cual podría llegar a aplicarse para dismi­nuir la actividad de las cicatrices hipertróficas o los queloides32.